本研究所用DMA玻片為經(jīng)過親水與超疏水處理的玻璃玻片。親水位點被超疏水區(qū)域間隔開。玻片為25 X 75 mm，包含588個邊長為1 mm的親水位點（圖2A、B）。

在此，我們同時采用了不連續(xù)的去濕技術(shù)（圖 1A上半部分）和非接觸式噴頭來將細(xì)胞直接打印到每個親水性點上（圖 1A下半部分）。如果是手動種細(xì)胞，細(xì)胞會被置于約 80 納升的液滴中，如果是使用機(jī)器接種，細(xì)胞會被置于 100 納升的液滴中。細(xì)胞接種完成后，將 DMA 玻片翻轉(zhuǎn)過來并放置在載玻片支架上，以形成懸掛液滴陣列（圖 1A和 2B）。帶有 DMA 玻片的載玻片支架被放入一個裝有緩沖液的 10 厘米培養(yǎng)皿中，并用含有濕潤墊的蓋子封閉，在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，防止培養(yǎng)過程中液滴的蒸發(fā)。24-48小時后即可形成單球陣列（圖2C、D）。這種單細(xì)胞球體陣列可用于進(jìn)行復(fù)合操作，在 DMA 玻片上直接進(jìn)行顯微鏡分析，每個球體都可以單獨進(jìn)行定位（圖 1B）。此外，還可以通過將球體從無壁表面沖洗至培養(yǎng)皿或其他容器中來輕松收集它們，以便進(jìn)行進(jìn)一步的實驗或分析（圖 1C）。因此，DMA 技術(shù)不僅可以作為球體篩選的平臺，還可以作為制造數(shù)百個均勻單球體的平臺，這些單球體還可用于各種應(yīng)用。

我們成功地從多種細(xì)胞類型（包括 MCF-7、HEK293 和 HeLa 細(xì)胞）中形成了球體（圖 2C 和 3）。

形成的球體在陣列中的大小分布與泊松分布相符，直徑偏差約為 14%，且兩種手動和自動接種方法的結(jié)果相當(dāng)（圖 2D）。在手動和自動接種方法中（圖 2D）。球體的大小取決于液滴中初始細(xì)胞的數(shù)量，并且可以通過改變初始細(xì)胞接種濃度來控制（圖 3C）

我們在不更換培養(yǎng)基的情況下對球體的生長和活力進(jìn)行了為期數(shù)天的監(jiān)測（圖 3A、B、E、F）。在培養(yǎng) 24 至 96 小時期間，HeLa 球體的直徑從 70 ± 10 微米增加到 100 ± 15 微米，而 HEK 293 球體的直徑則從 170 ± 10 微米減小到 140 ± 10 微米，MCF-7 球體的直徑則從 140 ± 20 微米減小到 110 ± 20 微米（圖 3A、B）。對于 HEK293 和 MCF-7 細(xì)胞系而言，細(xì)胞在培養(yǎng)初期就在液滴中心形成了較大的細(xì)胞團(tuán)塊，隨后在球體形成過程中細(xì)胞會逐漸緊密排列。這種在培養(yǎng)的前 2-3 天內(nèi)球體緊縮的過程已在之前得到證實。

接下來，我們對由HeLa細(xì)胞形成的球體進(jìn)行了三種不同抗癌藥物（多柔比星、奧沙利鉑和 5-氟尿嘧啶）的處理，并比較了HeLa球體和在二維單層培養(yǎng)中生長的HeLa細(xì)胞的劑量反應(yīng)情況（圖 4）。使用液體分配器將HeLa細(xì)胞以每 100 納升滴液 150 個細(xì)胞的量接種，并在懸滴中培養(yǎng) 48 小時使球體形成。之后，用50 納升藥物處理球體并將液滴陣列培養(yǎng) 72 小時。對于2D細(xì)胞培養(yǎng)，我們將HeLa細(xì)胞用液體分配器接種到 DMA 玻片上，并正置培養(yǎng) 5 小時以使細(xì)胞附著在表面，然相同的化合物處理，再培養(yǎng) 72 小時。最后，我們用鈣黃綠素和碘化丙啶（PI）對細(xì)胞進(jìn)行染色，分別用于可視化活細(xì)胞和死細(xì)胞。以3D和2D形式培養(yǎng)的細(xì)胞，圖 4 中顯示了劑量反應(yīng)曲線，表明這三種化合物對HeLa細(xì)胞的活力都有明顯的劑量依賴性影響。（圖 4）。3D培養(yǎng)的細(xì)胞比2D單層培養(yǎng)中的細(xì)胞更具耐藥性（圖 4），各地此前已有多次報道指出，與相同類型的單層培養(yǎng)細(xì)胞相比，腫瘤球體對抗癌化合物的抵抗力更強(qiáng)。

該研究在某些應(yīng)用中具有諸多優(yōu)勢，尤其適用于在納升滴體中對單個分離的球體進(jìn)行快速和高通量篩選，便于批量制造腫瘤球體。例如，將每個滴滴的體積縮小至 100 納升，可使化合物、試劑和細(xì)胞的使用量相比微孔板節(jié)省高達(dá) 99%。這種成本的顯著降低可能會為在藥物開發(fā)的早期階段進(jìn)行主要的超高通量篩選提供可能性，因為在這一階段會測試數(shù)百萬種化合物進(jìn)行表型篩選。每個球體只需使用 150 個細(xì)胞，這對于處理罕見且難以擴(kuò)增的細(xì)胞（如原代患者來源的腫瘤細(xì)胞）來說尤為重要。研究中使用的球體大小在 50 至 1000 微米之間不等。

研究表明，即使是直徑小于 100 微米的非常小的球體，在培養(yǎng) 2 天后也會出現(xiàn)氧梯度，并且會發(fā)展出缺氧狀態(tài)以及缺氧反應(yīng)元件（HRE）的激活現(xiàn)象，這證實了它們與體內(nèi)腫瘤在生理上的相似性。微滴陣列平臺具有靈活性，能夠通過改變初始細(xì)胞數(shù)量和親水性斑點的大小來培養(yǎng)不同大小的球體。研究表明，不同大小的球體對藥物治療的反應(yīng)可能不同，因此，應(yīng)根據(jù)應(yīng)用選擇合適的球體大小。在本研究中，我們的目標(biāo)是展示低起始細(xì)胞數(shù)量形成和篩選球體。這使得該系統(tǒng)在藥物敏感性和耐藥性測試方面具有吸引力。DMA 平臺特別適合形成具有統(tǒng)一球體大小的單個球體微陣列，這與包括 ULA 板在內(nèi)的許多其他方法不同，因為在 ULA 板中，每個孔中形成的球體的數(shù)量和大小是無法確定的。另一個優(yōu)點是可以直接在 DMA 蓋片上對球體進(jìn)行顯微鏡觀察，而無需將其轉(zhuǎn)移到微孔板中。由于小液滴的尺寸，球體的定位是固定的，這也簡化了顯微鏡觀察和圖像處理。最后，形成的均勻的細(xì)胞球體可以方便地收集到一個容器中，以供進(jìn)一步實驗使用，這對于從體外測試到再生醫(yī)學(xué)等各種應(yīng)用都非常重要。因此，本文所建立的單球體微陣列可以用于基礎(chǔ)研究、藥物發(fā)現(xiàn)以及精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的篩選工作流程中。