氨酰tRNA合成酶（aaRSs）是一類(lèi)與神經(jīng)退行性類(lèi)疾病CharcotMarie-Tooth(CMT）相關(guān)的蛋白家族。顯性突變導(dǎo)致了疾病的發(fā)生，對(duì)導(dǎo)致CMT疾病發(fā)生的突變的甘氨酸-tRNA合成酶（GlyRS)和酪氨酸-tRNA合成酶（TyrRS)的研究表明，突變使得蛋白產(chǎn)生與功能增強(qiáng)機(jī)制相一致的新的結(jié)構(gòu)。與此相反，通過(guò)單倍體酵母模型發(fā)現(xiàn)組氨酰-tRNA合成酶（HisRS)氨酰化功能的喪失與CMT疾病的發(fā)生相關(guān)。然而，沒(méi)有任何關(guān)于導(dǎo)致CMT疾病發(fā)生的以往報(bào)道是在真實(shí)病人來(lái)源的細(xì)胞樣本中證明tRNAs的氨酰化狀態(tài)。通過(guò)臨床病人來(lái)源的細(xì)胞中檢測(cè)氨酰化水平，本文研究了與HisRS相關(guān)的具有嚴(yán)重表型的CMT疾病家族。令人吃驚的是，在正常家庭成員和患病家庭成員之間，組氨酸結(jié)合型tRNA水平并沒(méi)有差異。并進(jìn)一步確認(rèn)，重組的4個(gè)促進(jìn)CMT發(fā)生的突變蛋白在體外活性的喪失和體內(nèi)表型的嚴(yán)重程度間無(wú)相關(guān)性。確實(shí)，其中一個(gè)對(duì)活性最具影響的突變只與輕微的疾病表型相關(guān)。在接下來(lái)的研究中，本文通過(guò)switchSENCE技術(shù)分析方法，證明在蛋白二聚化界面發(fā)生突變的HisRSs的開(kāi)放結(jié)構(gòu)與疾病的嚴(yán)重度密切相關(guān)。事實(shí)上，在極其嚴(yán)重的病人群體中，HisRSs的突變導(dǎo)致了最大程度的開(kāi)放型結(jié)構(gòu)。這些研究數(shù)據(jù)表明，與HisRS相關(guān)的CMT疾病產(chǎn)生于構(gòu)象變化誘導(dǎo)機(jī)制，而不是氨酰化水平的丟失。

CMT疾病是最為常見(jiàn)的外周神經(jīng)遺傳性病變，患病率約為1/2500。該疾病的特征為進(jìn)展性的肌無(wú)力，肌萎縮以及遠(yuǎn)端四肢感覺(jué)喪失且具有廣泛的遺傳異質(zhì)性特征。到目前為止，超過(guò)90個(gè)基因的突變與疾病的發(fā)生相關(guān)。然而，大多數(shù)基因的致病機(jī)制目前仍舊不清楚。涉及CMT疾病的最大基因家族編碼氨酰tRNA合成酶，目前涉及其中的6個(gè)家族成員（例如甘氨酰-，酪氨酰-，色氨酰-，組氨酰-，甲硫氨酰-tRNA合成酶），同時(shí)表明了解aaRS相關(guān)的CMT疾病發(fā)生機(jī)制的重要性。

aaRS通過(guò)催化氨基酸與相應(yīng)的tRNA結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)mRNA的翻譯，以在核糖體內(nèi)進(jìn)行蛋白質(zhì)的合成。氨酰化通過(guò)兩步實(shí)現(xiàn)。第一步，aaRS結(jié)合氨基酸和腺苷 5'-三磷酸（ATP），催化形成一種與酶結(jié)合的氨酰-腺苷酸酯，反應(yīng)過(guò)程釋放焦磷酸鹽（PPi）；第二步，激活后的氨基酸與tRNA反應(yīng)，產(chǎn)生氨酰-tRNA。

組氨酰-tRNA合成酶，是與CMT疾病相關(guān)的6種aaRSs中的一種，被歸類(lèi)為 CMT2W 亞型，其主要表現(xiàn)為軸索型癥狀，并且為常染色體顯性遺傳。根據(jù)新的CMT疾病分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，該亞型也被稱(chēng)為AD-CMTaxHARS。人類(lèi)的HisRS蛋白由三個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域組成：N-端的WHEP結(jié)構(gòu)域，催化結(jié)構(gòu)域和C端反密碼子結(jié)合域（請(qǐng)見(jiàn)Fig. 1A）。有趣的是，與CMT疾病相關(guān)的HisRS突變位于催化位點(diǎn)附近的催化結(jié)構(gòu)域（請(qǐng)見(jiàn)Fig. 1)。

人類(lèi)tRNA合成酶結(jié)構(gòu)

最初發(fā)現(xiàn)了4種CMT2W家族，每一種都與一個(gè)特定的突變相關(guān)聯(lián)（例如T132I, P134H, D175E, D364Y），且都具有強(qiáng)有力的遺傳學(xué)證據(jù)支持這一關(guān)聯(lián)。相對(duì)來(lái)說(shuō)，家族中攜帶P134H突變的病人表現(xiàn)出最為嚴(yán)重和長(zhǎng)期的癥狀，開(kāi)始于兒童期或青少年晚期。攜帶D364Y突變的病人表現(xiàn)相對(duì)嚴(yán)重（盡管這種突變的表型并不完全一致）。攜帶一個(gè)T132I或D175E突變的病人或者是受到輕微的影響或有多樣的疾病表現(xiàn)。疾病的嚴(yán)重程度通過(guò)不同的臨床因素聯(lián)合進(jìn)行評(píng)估，包括攜帶突變的病人患病的起始平均年齡以及癥狀的嚴(yán)重程度。為了理解在細(xì)胞內(nèi)，這些突變對(duì)tRNA氨酰化水平的影響，已有報(bào)道在單倍體酵母中進(jìn)行了遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)以評(píng)估蛋白的功能活性。由于4個(gè)突變中有3個(gè)突變（T132I, P134H, and D364Y）在單倍體酵母模型中導(dǎo)致了蛋白功能的完全喪失，而D175E HisRS保留部分活性，這些結(jié)果無(wú)法將疾病的嚴(yán)重程度與蛋白活性相關(guān)聯(lián)。其它2種與aaRS相關(guān)聯(lián)的CMT疾病亞型-CMT2D和DI-CMTC（分別與甘氨酰-tRNA和酪氨酰-tRNA合成酶相關(guān)），具有明顯的毒性功能獲得性機(jī)制。在分子結(jié)構(gòu)水平上，功能的獲得與突變誘導(dǎo)的更加開(kāi)放的構(gòu)象相關(guān)，該構(gòu)象暴露了新的分子表面，可以和大量的蛋白發(fā)生相互作用。此外，通過(guò)單倍體細(xì)胞進(jìn)行的酵母互補(bǔ)測(cè)定法，并不能直接的完全模擬具有二倍體的人類(lèi)細(xì)胞的情況。考慮到與CMT疾病關(guān)聯(lián)的aaRS突變的顯性特征以及病人中tRNA合成酶野生型等位基因的存在，需要通過(guò)病人樣本檢測(cè)蛋白活性，以更準(zhǔn)確的理解顯性突變對(duì)tRNA氨酰化的影響。在本文中，我們獲得了受P134H突變影響最嚴(yán)重的病人家族樣本，并通過(guò)多種方式對(duì)樣本進(jìn)行分析，包括Northern blot實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)內(nèi)源性的tRNA乙酰化狀態(tài)。在P134H突變的病人以及野生型的成員之間，組氨酸t(yī)RNA的氨酰化和其他tRNAS的氨酰化，未呈現(xiàn)出結(jié)果上的差異。進(jìn)一步分析純化的重組HisRS和4種導(dǎo)致疾病發(fā)生的突變HisRS，確認(rèn)了酶活性和疾病嚴(yán)重程度之間無(wú)相關(guān)性。與此相反，利用switchSENCE技術(shù)檢測(cè)蛋白流體動(dòng)力學(xué)大小變化，結(jié)果顯示，與其它突變蛋白相比，HisRS P134H突變能夠誘導(dǎo)最大程度的構(gòu)象變化和結(jié)構(gòu)的開(kāi)放狀態(tài)，并且開(kāi)放的構(gòu)象與CMT疾病的病情緊密相關(guān)。

驗(yàn)證HisRS攜帶P134H突變的

CMT病患樣本的tRNA氨酰化情況

酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)中，HisRS P134H完全無(wú)法支持細(xì)胞的生長(zhǎng)，表明突變蛋白缺乏將tRNA與組氨酸結(jié)合的酶活性。為了在P134H的病人樣本中更進(jìn)一步理解是否野生型HARS等位基因能夠提供足夠的酶活性以代償?shù)任换蛲蛔冊(cè)斐傻墓δ軉适В覀兎治隽薈MT2W病人家族中的HisRS酶活性。首先比較了來(lái)自于2例P134H病人和2例沒(méi)有攜帶突變的正常家族的永生的淋巴細(xì)胞中的HisRS蛋白水平，未發(fā)現(xiàn)差異（請(qǐng)見(jiàn)Fig. 2A)，表明突變未影響HisRS的表達(dá)和穩(wěn)定性。為了評(píng)估HisRS的酶活性，我們通過(guò)Northern blot檢測(cè)在這些樣本中，內(nèi)源性tRNAs的原位氨酰化狀態(tài)。提取樣本總RNAs并于酸性條件下進(jìn)行凝膠電泳，以維持tRNAs的酰化狀態(tài)。細(xì)胞中，同源胞質(zhì)型 tRNA 的帶電部分（結(jié)合組氨酸）占比約為 50%，該水平在病人和健康的家族樣本中是一致的（Fig. 2B)。做為對(duì)照，我們鑒定了非同源的細(xì)胞質(zhì)tRNA（tRNAAIa)和線粒體tRNA的His水平，同樣未發(fā)現(xiàn)差異（請(qǐng)見(jiàn)Fig. 2B)。接下來(lái)，為了確認(rèn)病人樣本中酶活性喪失的情況，我們使用細(xì)胞裂解液進(jìn)行了體外氨酰化檢測(cè)，比較了蛋白將tRNA氨酰化的能力。我們發(fā)現(xiàn)在2例CMT樣本和對(duì)照樣本中，氨酰化酶活性并未降低（請(qǐng)見(jiàn)Fig. 2C)。明顯的是，與野生型HisRS相比，P134H突變的HisRS未產(chǎn)生（顯性）負(fù)效應(yīng)，以減弱細(xì)胞中tRNA的氨酰化的能力。因此，我們推斷在大多數(shù)嚴(yán)重的病人細(xì)胞中，tRNA攜帶His的水平未受到影響。

細(xì)胞內(nèi)tRNA氨酰化水平檢測(cè)

CMT2W突變的酶活性和疾病的

病情間無(wú)相關(guān)性

HisRS D175E的晶體結(jié)構(gòu)分析表明

在酶活性位點(diǎn)未發(fā)生構(gòu)象改變

突變蛋白Km的增加表明活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)改變的潛在可能性。我們對(duì)CMT2W的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。我們獲得了3種突變體的晶體結(jié)構(gòu)，分別是HisRST132I , HisRSD175E和HisRSD364Y。 然而，僅HisRS D175E獲得了高分辨的晶體結(jié)構(gòu) (3.1 ?)。我們利用野生型的結(jié)構(gòu)做為模版，通過(guò)分子代替解析突變體的晶體結(jié)構(gòu)。

有趣的是，HisRS D175E 的晶體結(jié)構(gòu)與 HisRS WT 的結(jié)構(gòu)非常相似，其 376 個(gè) Cα 原子的均方根偏差為0.97 ?。用于突變體的結(jié)晶條件和用于野生型蛋白的結(jié)晶條件幾乎相同。在ATP-或組氨酸結(jié)合點(diǎn)我們未觀測(cè)到明顯的差異，和我們從動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)得到的預(yù)期相一致（請(qǐng)見(jiàn)Fig. 4)。我們將構(gòu)象變化的缺失歸因于晶格引起的限制，正如我們?cè)谄渌鸆MT疾病相關(guān)的tRNA合成酶突變中觀測(cè)到的，我們進(jìn)而分析蛋白在溶液中的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

組氨酰tRNA合成酶野生型及突變型晶體結(jié)構(gòu)分析

switchSENCE技術(shù)證實(shí)CMT2W蛋白

突變對(duì)蛋白大小的影響

為了證實(shí)觀測(cè)到的所有4種CMT突變能夠誘導(dǎo)蛋白形成疏松結(jié)構(gòu)，我們利用switchSENCE技術(shù)評(píng)估這些蛋白的流體動(dòng)力學(xué)半徑。短的雙鏈DNA一端被偶聯(lián)在芯片的金屬表面，另一端與待測(cè)蛋白進(jìn)行結(jié)合（請(qǐng)見(jiàn)Fig. 4)。交替變換的正負(fù)電壓作用于該DNA雙鏈，并通過(guò)與DNA雙鏈連接的熒光探針實(shí)時(shí)記錄蛋白的運(yùn)動(dòng)軌跡。一旦HisRS蛋白偶聯(lián)到DNA雙鏈，DNA雙鏈的流體動(dòng)力學(xué)摩擦系數(shù)受到影響，DNA的運(yùn)動(dòng)速率也同樣受到影響。儀器記錄DNA雙鏈的運(yùn)動(dòng)情況，通過(guò)該運(yùn)動(dòng)的變化情況估測(cè)蛋白的流體動(dòng)力學(xué)半徑。我們發(fā)現(xiàn)所有的突變體，與野生型相比，流體動(dòng)力學(xué)半徑都有不同程度的增加，相對(duì)增加程度在4%和20%之間。HisRS T132I的增加是最小的，與野生型相比，僅有4%的增加。HisRSP134H , HisRSD175E 和HisRSD364Y的變化較為相似，分別為18%，20%和16%。

組氨酰tRNA合成酶野生型及突變型晶體結(jié)構(gòu)分析

switchSENCE技術(shù)檢測(cè)

氨酰tRNA合成酶的構(gòu)象變化

通過(guò)測(cè)量HisRS突變體的活性，我們可以推斷活性和疾病病情間的相互關(guān)聯(lián)，同樣，我們也可以推論蛋白構(gòu)象變化和疾病病情間的相互關(guān)聯(lián)情況。蛋白由于構(gòu)象的改變暴露的新的界面可能介導(dǎo)了多種相互作用和毒性功能獲得性效應(yīng)，導(dǎo)致疾病的發(fā)生和發(fā)展（請(qǐng)見(jiàn)Fig. 5)。總的來(lái)說(shuō)，本研究提供了一種在CMT患者細(xì)胞中研究tRNA合成酶的方法。本研究將疾病的表型和蛋白結(jié)構(gòu)的改變進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，為將來(lái)的分子機(jī)制研究打開(kāi)了一種新的思路。

蛋白構(gòu)象改變誘導(dǎo)新相互作用界面產(chǎn)生的示意圖