圖1評(píng)估TPT3：NAM堿基對(duì)的逆轉(zhuǎn)錄的實(shí)驗(yàn)流程示意圖。帶有非天然核苷酸rTPT3或rNAM的RNA對(duì)具有不同的逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。用不同的方法分析了逆轉(zhuǎn)錄的加工性（請(qǐng)參閱上圖，逆時(shí)針）：通過PAGE檢測(cè)全長(zhǎng)與截短的cDNA比率，通過LC-MS和Sanger測(cè)序檢測(cè)LC-MS融合cDNA，使用switchSENSE^®技術(shù)及模擬SELEX循環(huán)的動(dòng)力學(xué)測(cè)量，以探索UB保留周期數(shù)。

特別的，在本研究中（見圖2）利用switchSENSE^®技術(shù)及heliX+設(shè)備對(duì)逆轉(zhuǎn)錄過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，使得MMLV和SSIV RT與RNA模板的結(jié)合和活性的動(dòng)力學(xué)得以表征。

本研究通過在switchSENSE^®芯片上構(gòu)建檢測(cè)體系，實(shí)現(xiàn)了對(duì)UBP摻入的動(dòng)態(tài)量化測(cè)量。因此switchSENSE^®是研究其他逆轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶活性強(qiáng)有力的技術(shù)手段。

圖2 switchSENSE^®生物芯片上的MMLV和SS IV RT活性測(cè)定流程示意圖。（A）芯片測(cè)試示意圖。首先，配體通過雜交固定在單個(gè)鏈錨定（1）。隨后，將RT與芯片核酸結(jié)合（2），然后注射dNTPS或DNTPS + dNaM TP以啟動(dòng)逆轉(zhuǎn)錄（3）。最后，芯片被再生（4）。（B）在存在或不存在不同模板的dNaM TP的情況下，每個(gè)MMLV和SS IV RT的相對(duì)振幅，包括其標(biāo)準(zhǔn)偏差（N≥3），這些偏差來自延伸幅度的熒光變化。將48-1XRTPT3、48-2XRTPT3和24-NT RNA的值標(biāo)準(zhǔn)化為48-NT未修飾的RNA。（C）在結(jié)合階段，MMLV的熒光變化信號(hào)。（D）在不同dNTP濃度下逆轉(zhuǎn)錄（伸長(zhǎng)）期間熒光變化的增加。（E）在底物濃度上繪制觀察到的速率以獲得催化速率圖 Kcat。