目前，電驅(qū)動的DNA納米桿相關(guān)技術(shù)，被用于檢測流感病毒，比如Influenza A/Aichi/2/1968，與其受體蛋白/肽PeB的相互作用。該受體蛋白能夠與病毒顆粒表面的血球凝集素蛋白特異性的結(jié)合。
該技術(shù)被稱為switchSENCE，其原理是將DNA鏈錨定在生物芯片的表面，并將受體肽PeB與DNA鏈進(jìn)行耦合，以實(shí)現(xiàn)將受體肽固定在芯片表面的目的。同時(shí)，其中錨定在芯片表面的單鏈DNA攜帶熒光基團(tuán)，而與其互補(bǔ)的DNA鏈則根據(jù)研究的需要，可以設(shè)計(jì)攜帶多價(jià)肽等受體分子。形成的雙鏈DNA納米桿，在芯片電極提供的負(fù)電壓條件下，可以保持直立的靜止?fàn)顟B(tài)。信號的檢測基于互作事件發(fā)生后，對熒光基團(tuán)周圍環(huán)境的改變，導(dǎo)致了熒光信號改變的發(fā)生。本研究中，病毒顆粒與肽的相互作用信號的產(chǎn)生說明病毒可以直接做為配體，特異性與固定在芯片表面的受體肽結(jié)合，且在較長的時(shí)間范圍內(nèi)，病毒能夠保持正常活性，處于穩(wěn)定的結(jié)合狀態(tài)。此外，通過該技術(shù)，可以比較不同的病毒亞型與同一受體肽的結(jié)合性能。總的來說，本研究證實(shí)switchSENCE技術(shù)可以利用病毒本身做為研究材料，在病毒顆粒原生態(tài)的環(huán)境下檢測受體與病毒表面配體的互作性能。
流行性病毒的爆發(fā)，給人類的生命健康帶來極大的威脅，比如嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-Cov-2)的發(fā)生及流行。帶來類似嚴(yán)重后果的還有在1918年爆發(fā)的A型流感病毒Spanish flu, 導(dǎo)致了全世界數(shù)百萬人口的死亡。A型流感病毒屬于正黏病毒科，其具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，膜的表面表達(dá)三種膜蛋白：血球凝集素蛋白（HA），神經(jīng)氨酸苷酶（NA）和M2質(zhì)子通道蛋白。神經(jīng)氨酸苷酶可以促進(jìn)病毒顆粒從被感染的細(xì)胞釋放，并裂解糖苷酶鍵；HA可以在病毒與細(xì)胞融合之前，與細(xì)胞表面含有唾液酸（SA）的細(xì)胞受體結(jié)合。HA為同源三聚體結(jié)構(gòu)，在其蛋白的球形頭部結(jié)構(gòu)域攜帶三個(gè)SA結(jié)合位點(diǎn)。單價(jià)肽與病毒的結(jié)合的親和性在mM級，但HA在病毒表面廣泛表達(dá)，可與多個(gè)SA分子發(fā)生互作，表現(xiàn)出更高的結(jié)合性能，我們也將其稱為avidity。對病毒與其受體結(jié)合的affinity與avidity的研究，將可以幫助我們更有效的理解病毒內(nèi)化和感染的過程。由于其復(fù)雜的結(jié)合形式，需要新的技術(shù)手段對其進(jìn)行檢測分析。例如，表面等離子共振技術(shù)（SPR），核磁共振技術(shù)，或者電測量等。
本研究中，我們利用switchSENCE技術(shù)，對HA和其受體肽的結(jié)合動力學(xué)進(jìn)行了檢測。該技術(shù)是利用電子驅(qū)動的DNA納米桿實(shí)現(xiàn)。該DNA納米桿通過化學(xué)作用，與生物芯片進(jìn)行結(jié)合。該技術(shù)已經(jīng)廣泛用于蛋白-蛋白，蛋白-核酸適配體以及蛋白-DNA等分子之間的互作分析。而本研究是將該技術(shù)第一次用于病毒-肽的互作檢測。
switchSENCE技術(shù)，不僅可以檢測分子互作之間的親和性（KD），同時(shí)可以實(shí)時(shí)檢測結(jié)合常數(shù)（Kon)和解離常數(shù)（Koff)。在藥物發(fā)現(xiàn)研究領(lǐng)域，這些分子互作參數(shù)，對于潛在藥物性能的評估至關(guān)重要。分子互作的親和性，可以通過傳統(tǒng)的MST，ITC等技術(shù)進(jìn)行檢測，但是它們無法測量實(shí)時(shí)的結(jié)合和解離常數(shù)，并且需要進(jìn)行熒光標(biāo)記，而switchSENCE技術(shù)可以在不標(biāo)記互作分子的情況下，檢測其相互作用動力學(xué)參數(shù)。與其相似的傳統(tǒng)技術(shù)有表面等離子共振技術(shù)（SPR)，兩者在測量分子互作方面具有非常多的相似性和優(yōu)點(diǎn)，比如：（1）不僅可以測量親和性，同時(shí)可以實(shí)時(shí)檢測動力學(xué)參數(shù)；（2）都不需要進(jìn)行標(biāo)記；（3）較低的樣本消耗量；（4）數(shù)據(jù)檢測的較高靈敏度；兩種技術(shù)也有相似的不足之處，比如：（1）都需要將其中一個(gè)分子進(jìn)行固定，固定本身可能會影響分子互作性能的檢測；（2）微流控下的物質(zhì)運(yùn)動的限制；（3）非特異性結(jié)合發(fā)生的可能性。不論是SPR還是switchSENCE技術(shù)，對數(shù)據(jù)的解讀都非常重要，需要研究人員的經(jīng)驗(yàn)和對儀器的深入了解，以實(shí)現(xiàn)對結(jié)果進(jìn)行科學(xué)合理的評估。
和SPR相比，switchSENCE技術(shù)具有相應(yīng)的優(yōu)勢，其中之一是可以控制受體在其表面結(jié)合的密度，以減少分子的聚集，并可以按照不同比例分布兩種不同的分子。此外，switchSENCE技術(shù)由于利用了DNA互補(bǔ)雜交原理，因此可以應(yīng)用于多種類型的分子互作場景；尤其當(dāng)待檢測的受體分子是DNA為基礎(chǔ)的結(jié)構(gòu)，比如DNA-肽納米結(jié)構(gòu)，更具有操作上的優(yōu)勢。除此之外，switchSENCE技術(shù)還能夠用于測量蛋白構(gòu)象變化以及流體動力學(xué)半徑測量，這些是SPR無法實(shí)現(xiàn)的功能。
PeB受體肽起源于單克隆抗體HC19免疫球蛋白可變區(qū)域的互補(bǔ)決定區(qū)，已經(jīng)報(bào)道，其對HA2, NA3具有中和效應(yīng)。已經(jīng)證實(shí)，它能夠與A型流感病毒株Aichi H3N2的HA蛋白結(jié)合，其親和性在uM級。雖然該親和性相比單價(jià)分子間親和性已大大提高，對于治療型抗體的效率來說，仍舊需要進(jìn)一步優(yōu)化和提高。
為了實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步優(yōu)化的目的，許多改進(jìn)的方法嘗試多價(jià)互作的形式，以增強(qiáng)小分子配體與生物受體復(fù)合物的靶向效率。對于流感病毒的HA受體，其唾液酸配體的結(jié)合位點(diǎn)為有序排列的三聚體復(fù)合物，兩個(gè)鄰近位點(diǎn)之間的距離大約為4.2nm。在一些實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，以DNA或其它核酸為基礎(chǔ)的納米桿，已經(jīng)做為一種呈遞HA結(jié)合配體的骨架，應(yīng)用于研究中。由于該骨架操作的靈活性，可以呈遞單價(jià)，二價(jià)或三價(jià)配體，因此提高了分子之間的結(jié)合性能；該設(shè)計(jì)的第二個(gè)優(yōu)勢，體現(xiàn)在遵循沃森-克里克的堿基互補(bǔ)配對原則的DNA骨架設(shè)計(jì)，使得多種類型的分析檢測更加的直觀化。通過延長非配對的單鏈序列，使其可以做為簡單的模塊，與互補(bǔ)配對鏈共同錨定在分析檢測表面。例如，本研究第一次報(bào)道了，利用switchSENCE技術(shù)對病毒與錨定在芯片表面的DNA-肽的互作動力學(xué)進(jìn)行檢測。
互作分析通過以switchSENCE技術(shù)為基礎(chǔ)的DRX2（Dynamic Biosensors GmbH, Germany）儀器實(shí)現(xiàn)。使用的芯片為MPC-48-1-R1-S 或 MPC2-48-2-G1R1-S（Dynamic Biosensors GmbH）。每個(gè)微流控芯片由四個(gè)獨(dú)立的液流通道組成，詳情見Figure 1a。
Figure 1: 生物芯片結(jié)構(gòu)及DNA納米桿結(jié)構(gòu)示意圖
每一個(gè)通道寬1mm, 高60um, 包含六個(gè)金屬電極，長度為3.34mm, 每個(gè)電極直徑為120um, 其與電源相連。每一個(gè)電極都與DNA納米桿相連接。單鏈DNA納米桿（NL-B48，序列請見Table 1)通過5’端與芯片表面共價(jià)結(jié)合，在序列3’端攜帶有用于信號檢測的熒光基團(tuán)。互補(bǔ)配對的DNA鏈（cNL-B48，序列請見Table 1），可以與待檢測的目標(biāo)分子進(jìn)行交聯(lián)。在本研究中，受體肽（SA)與互補(bǔ)配對的DNA鏈進(jìn)行交聯(lián)。通過DNA分子雜交，使得互補(bǔ)配對鏈DNA-肽與芯片表面的DNA鏈進(jìn)行結(jié)合，形成雙鏈DNA。該雙鏈DNA可以用于后續(xù)的電驅(qū)動的互作分子檢測。其結(jié)構(gòu)請參見Figure 1。由于電源可以交替產(chǎn)生正/負(fù)電壓（AC），因此能夠使得帶有負(fù)電荷的雙鏈DNA在芯片表面進(jìn)行擺動，被稱為“dynamic mode”；電源也可以是保持不變的負(fù)電壓（DC），使得DNA雙鏈保持直立狀態(tài)，被稱為“static mode”。對于動力學(xué)模式，AC電壓的范圍是-0.3V到0.5V，變化頻率為10kHz. 在動力學(xué)模式下進(jìn)行測量時(shí)，當(dāng)DNA雙鏈接近金屬電極時(shí)，由于發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，熒光信號發(fā)生淬滅，當(dāng)其離開芯片表面時(shí)，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，進(jìn)而產(chǎn)生周期性的熒光信號的改變。改變過程中發(fā)生的熒光光子數(shù)，通過實(shí)時(shí)的單光子計(jì)數(shù)技術(shù)（e-TCSPC）進(jìn)行檢測。在結(jié)合事件發(fā)生后，由于整體納米桿的流體動力學(xué)摩擦系數(shù)的增加，造成了DNA納米桿在該流體系統(tǒng)中運(yùn)動速率的減慢，速率的變化可以通過實(shí)時(shí)的熒光變化進(jìn)行檢測。在靜止模式下，電壓可以保持在固定數(shù)值，本研究中為-0.1V，DNA保持在直立靜止?fàn)顟B(tài)。該狀態(tài)下，由于結(jié)合事件的發(fā)生，導(dǎo)致熒光基團(tuán)周圍的生化，物理等環(huán)境的改變，熒光基團(tuán)的信號發(fā)生改變，這種改變不受所結(jié)合的分子大小的影響，而是受結(jié)合位點(diǎn)周圍化學(xué)環(huán)境的影響，因此主要依賴于互作的類型。
Table 1 DNA納米桿構(gòu)成序列
DNA按照Table 1中的序列進(jìn)行合成。cNL-B48和NL-W48-B48-G1購于Dynamic Biosensors GmbH，寡核苷酸p-cNL-B48, n, n*o, 和 o*p* （見Table 1) 購于Biomers.net. p-cNL-B48寡核苷酸鏈可以部分的與固定在芯片表面的NLB-48核酸鏈互補(bǔ)。攜帶有氨基基團(tuán)的寡核苷酸鏈（p-cNL-B48, n*o, o*p*）與PeB肽進(jìn)行交聯(lián)并進(jìn)行純化；隨后，攜帶PeB肽的寡核苷酸鏈折疊成四臂結(jié)構(gòu)，請見Figure 2。在進(jìn)行動力學(xué)檢測之前，肽與寡核苷酸的耦合效率可以通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量評估。該遞呈肽的DNA結(jié)構(gòu)，在未與肽結(jié)合時(shí)分子量為43kDa，與三肽結(jié)合后的分子量為49kDa.
Figure 2 寡核苷酸-三肽偶合結(jié)構(gòu)
分子互作檢測通過DRX2儀器（Dynamic Biosensors GmbH, Martinsried, Germany）進(jìn)行。在本測量中，使用的生物芯片序列號為MPC-48-1-R1-S 或MPC2-48-2-G1R1-S（Dynamic Biosensors GmbH）。測量實(shí)驗(yàn)流程通過switchBUILD軟件實(shí)現(xiàn)，并通過switchCONTROL軟件逐步實(shí)行（軟件由Dynamic Biosensors GmbH提供）。芯片上每一個(gè)微流控通道在正式檢測前，需要使用含有硫醇基的鈍化溶液進(jìn)行處理，然后進(jìn)行芯片質(zhì)量檢測，以保證芯片在良好的狀態(tài)下檢測到最大強(qiáng)度的熒光信號。DNA鏈以500nM的濃度與芯片進(jìn)行雜交，雜交時(shí)間為320s，該互作動力學(xué)檢測在靜止模式下進(jìn)行。底物的分析濃度范圍為10-40ug/ml。對于結(jié)合過程，底物上樣體積為50ul，流速為1ul/min，結(jié)合時(shí)間為50min; 對于解離過程，流速為3ul/min，解離時(shí)間為13.3分鐘。
在三明治模式的動力學(xué)檢測中，使用的是NL-W48-B48-G1寡核苷酸鏈，其部分與cNL-B48互補(bǔ)。該寡核苷酸鏈攜帶有綠色熒光基團(tuán)。在檢測之前，DNA鏈（NL-W48-B48-G1 和DNA 納米結(jié)構(gòu)ss1/2/3PeB）進(jìn)行雜交，使得DNA納米結(jié)構(gòu)標(biāo)記上綠色熒光，用于后續(xù)檢測。兩條互補(bǔ)寡核苷酸鏈以1:1的比例混合，避光室溫孵育1小時(shí)。三明治檢測模式是以ss2PeB做為配體，將病毒X31進(jìn)行捕獲，然后以肽-DNA 結(jié)構(gòu)ss1/2/3PeB-NL-W48-B48-G1做為底物進(jìn)行上樣分析其與病毒結(jié)合的動力學(xué)。該測量在swithcSENCE靜止模式下進(jìn)行。
相互作用檢測的基礎(chǔ)為與芯片耦合的攜帶熒光基團(tuán)的DNA寡核苷酸鏈（NL-B48）以及與其互補(bǔ)配對的攜帶有受體肽的寡核苷酸鏈。病毒顆粒在該檢測中，做為底物進(jìn)行上樣分析。DNA之間雜交形成納米結(jié)構(gòu)是在動力學(xué)模式（dynamic mode）下進(jìn)行（請見Figure 3)，病毒顆粒的結(jié)合是在靜止模式下進(jìn)行（static mode)。熒光基團(tuán)信號的變化，表征結(jié)合事件的發(fā)生。DNA鏈雜交后，檢測將轉(zhuǎn)為靜止模式，DNA-肽結(jié)構(gòu)處于直立靜止?fàn)顟B(tài)。本檢測中，互補(bǔ)配對的第二條DNA寡核苷酸鏈具有四個(gè)核苷酸臂，其中之一部分與固定在芯片上的NL-B48單核苷酸鏈進(jìn)行互補(bǔ)，其余三條臂分別攜帶一個(gè)肽分子PeB。在具體實(shí)驗(yàn)中，可靈活設(shè)計(jì)攜帶有單個(gè)，二個(gè)，三個(gè)或不攜帶肽分子的DNA結(jié)構(gòu)。Figure 3b表示的是cNLB48以及ss3PeB和固定在芯片上的NLB-48雜交的示意圖。雜交的過程，提供的是交替變換的電壓，在互補(bǔ)配對鏈結(jié)合之前，單鏈DNA的運(yùn)動是比較微弱的，可能由于單鏈結(jié)構(gòu)的靈活性，使得熒光基團(tuán)與芯片表面的距離比較接近，熒光信號變化幅度較低。一旦與互補(bǔ)鏈配對，請見Figure 3, 雙鏈DNA的移動幅度大大增加，熒光信號變化的幅度隨之提升。從Figure 3可以得知，相比于未攜帶肽分子的互補(bǔ)配對鏈, ss3PeB與NL-B48雜交的效率更高，這可能是由于大分子擴(kuò)散速率慢，且DNA雙鏈更長，攜帶更多的負(fù)電荷。
Figure 3 芯片雜交信號檢測
芯片雜交完成后，病毒顆粒做為底物進(jìn)行上樣，與肽分子進(jìn)行結(jié)合。請見Figure 4。數(shù)據(jù)以ss2PeB與病毒的結(jié)合進(jìn)行展示。在結(jié)合過程中，保持1ul/min的低液流速率，以保證反應(yīng)不受快速擴(kuò)散的影響。因?yàn)镈NA納米桿的長度大約為20nm，圓形病毒顆粒的平均直徑大約為120nm，桿狀病毒顆粒的長度約為300nm。因此單個(gè)病毒可能與一個(gè)以上的DNA納米桿單位進(jìn)行結(jié)合。
Figure 4 病毒顆粒與ss2PeB結(jié)合示意圖
Figure 5展示了不同濃度的X31病毒顆粒和ss2PeB結(jié)合的動力學(xué)。X31病毒顆粒經(jīng)液流注入系統(tǒng)后，即可觀察到濃度依賴的熒光信號減少的發(fā)生。在每一次測量后，芯片都需要再生，然后重新進(jìn)行DNA鏈的雜交。經(jīng)實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，在極限的750s解離時(shí)間內(nèi)，病毒顆粒仍舊穩(wěn)定的結(jié)合在DNA納米桿結(jié)構(gòu)上。從已有的報(bào)道可知，病毒蛋白與其受體結(jié)合的親和性在uM級，這與該實(shí)驗(yàn)中觀測到的解離結(jié)果不符。這可能是由于在該研究中，病毒顆粒與受體的結(jié)合是多價(jià)模式，導(dǎo)致了結(jié)合的avidity效應(yīng)的發(fā)生，結(jié)合更加的穩(wěn)定。因此，這種方法使得對真實(shí)的親和性的檢測受到限制。做為陰性對照，ss0PeB(DNA鏈未與肽分子偶聯(lián)）用于檢測病毒顆粒的非特異性結(jié)合。結(jié)果表明，病毒顆粒與肽的結(jié)合是特異性的。
Figure 5 X31病毒顆粒與ss2PeB結(jié)合動力學(xué)
該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是將病毒顆粒做為生物材料，固定在芯片表面，目的是為了檢測到受體肽與其結(jié)合的解離常數(shù)及親和性。在本研究中，ss2PeB與芯片進(jìn)行雜交，形成雙鏈DNA納米桿，經(jīng)由DNA鏈被標(biāo)記成紅色熒光；隨后，X31病毒顆粒被ss2PeB捕獲。在上述實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)過程中，病毒顆粒與肽的結(jié)合非常牢固，無解離的發(fā)生，因此可將該病毒顆粒做為固定的配體，進(jìn)行后續(xù)的二次動力學(xué)結(jié)合檢測。可將標(biāo)記綠色熒光基團(tuán)的肽-DNA鏈做為分析底物，與固定結(jié)合的病毒進(jìn)行結(jié)合。
Figure 6展示了該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的原理圖。ss2PeB-G1與X31的結(jié)合，導(dǎo)致了綠色熒光通道信號的逐步增強(qiáng)。對于結(jié)合的起始點(diǎn)，該模式中也有了明顯的信號改變。總的來說，無論是結(jié)合還是解離，該模式下的熒光信號改變都非常明顯，能夠讓研究人員更加準(zhǔn)確的判斷結(jié)合的起始和解離的過程。通過該三明治模式，可以對肽與病毒結(jié)合的解離動力學(xué)進(jìn)行研究。在本研究中，經(jīng)測量，兩者的結(jié)合常數(shù)為 kon = (1.8 ± 0.8) × 10 5 M ?1 s?1 ，解離常數(shù)為 koff = (2.3 ± 0.2) × 10 ?3 s?1，親和性為KD = (12 ± 7) nM。未捕獲病毒的DNA納米桿做為對照，用以排除非特異性結(jié)合。除了ss2PeB，單價(jià)肽ss1PeB-G1和三價(jià)肽ss3PeB-G1也進(jìn)行了相應(yīng)的檢測，三種復(fù)合物得到了較為相似的結(jié)合和解離動力學(xué)常數(shù)。ss1PeB-G1, KD = (12 ± 9) nM ，ss3PeB-G1, KD=(8 ± 7) nM.
Figure 6 三明治模式檢測病毒與肽結(jié)合的動力學(xué)
本研究證實(shí)了DNA納米結(jié)構(gòu)可以用于病毒-肽的互作動力學(xué)分析。利用switchSENCE技術(shù)，將PeB與DNA單鏈進(jìn)行耦合，并與A型流感病毒X31進(jìn)行結(jié)合，該結(jié)合信號隨病毒濃度的變化而變化。但由于兩者結(jié)合中的多價(jià)效應(yīng)存在，無法通過該模式對解離動力學(xué)進(jìn)行檢測。在三明治設(shè)計(jì)模型中，我們可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)對結(jié)合和解離動力學(xué)進(jìn)行分析，進(jìn)而得到兩者互作的親和性。在這種模式下，兩者之間的多價(jià)效應(yīng)對動力學(xué)檢測的影響較小。后續(xù)對于該技術(shù)更深入的探索研究，可以對DNA納米骨架進(jìn)行優(yōu)化（比如單臂的長度，中心結(jié)點(diǎn)的靈活度等），以最大程度的減小單價(jià)遞呈模塊對結(jié)合動力學(xué)的影響。目前，由于測量誤差太大還不能夠區(qū)分單價(jià)結(jié)合的親和性常數(shù)，需要更長的解離時(shí)間以達(dá)到檢測的目的。總的來說，進(jìn)行病毒-肽之間的互作動力學(xué)分析，在傳統(tǒng)的SPR技術(shù)中遇到了一定的阻礙。由于病毒顆粒結(jié)構(gòu)和蛋白表達(dá)的豐度，需要考慮受體的密度，物質(zhì)的流動速率以及樣本制備等方面。在switchSENCE技術(shù)中，受體的密度可以通過單鏈DNA納米桿的數(shù)量進(jìn)行控制。實(shí)驗(yàn)后芯片再生的過程，也會影響到受體的密度，減少了芯片上高質(zhì)量納米桿的數(shù)量，這是在實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性驗(yàn)證方面需要進(jìn)行考慮的問題；對于物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的限制，可以通過減少芯片上受體的數(shù)量以及增加流速解決。然而，芯片上受體數(shù)量的減少的同時(shí)，還需要考慮儀器整體的信噪比。對于多價(jià)結(jié)合的動力學(xué)曲線，單指數(shù)模型無法準(zhǔn)確的擬合，需要更多的擬合模型應(yīng)對復(fù)雜的互作動力學(xué)結(jié)果。總的來說，switchSENCE技術(shù)可以廣泛的應(yīng)用到肽的優(yōu)化，病毒與不同受體，包括核酸適配體，肽，抗體或者蛋白等分子結(jié)合的定量和定性分析，并且該技術(shù)可以更方便的用于單價(jià)和多價(jià)結(jié)合動力學(xué)分析。
