2016年，世界衛生組織（WHO）將多替拉韋（DTG）列為HIV感染一線治療藥物，其高效的病毒抑制能力與良好的安全性迅速使其成為全球首選方案。然而，2018年博茨瓦納Tsepamo研究打破了這一樂觀局面——孕期暴露于DTG的女性，胎兒神經管缺陷（NTD）風險較非DTG治療組升高9倍（0.94%vs.0.12%）[1]，這一發現引發全球對DTG妊娠期安全性的高度關注。
NTD是全球最常見的出生缺陷之一，其發生與胚胎神經管閉合異常密切相關，而葉酸缺乏是明確的風險修飾因子——孕前3個月至孕期補充400 μg/天葉酸可降低50%-75%的NTD發生率[2,3]。值得注意的是，博茨瓦納等未強制實施葉酸強化食品政策的地區，人群葉酸缺乏率超過20%，而DTG被證實可非競爭性拮抗葉酸受體1（FOLR1），在臨床治療濃度（3-10 μM）下降低葉酸與受體結合效率達46%。這提示DTG的致畸性可能與葉酸水平存在交互作用，但傳統檢測技術因無法精準量化低葉酸狀態下的代謝波動，導致“藥物-營養”協同效應的機制研究停滯不前。
1.實驗對象
實驗對象為CD-1 品系孕鼠（Charles River Laboratories），適應性喂養 4 周后分為兩組飲食：正常葉酸組（NF）：3mg/kg 葉酸飲食（模擬人類推薦攝入量[3]）；低葉酸組（LF）：0.3mg/kg 葉酸飲食（模擬葉酸缺乏環境，葉酸含量僅為正常組 10%）。
2.DTG暴露
胚胎期E6.5-E12.5（神經管閉合關鍵期），通過飲水給予DTG：
對照組（0X）：飲用純水；
治療劑量組（1X）：3.5mg/L（人類等效劑量[4]）；
超治療劑量組（5X/10X）：17.5mg/L、35mg/L，模擬臨床過量暴露場景；
樣本量：每組20-24只孕鼠，足月（E18.5）剖宮取胎，共檢測1200+胎兒。
基于葉酸結合蛋白（FBP）的競爭結合法，利用Dispendix I.DOT 非接觸式液體處理器構建高靈敏度檢測體系[5]：
1. 探針陣列打印：在96孔板底部以2×2陣列形式打印50ng/mLFBP（Sigma-AldrichF0504），單孔反應體積僅40μL（傳統方法需200μL），試劑消耗降低80%；
2. 標準曲線構建：配置0.09375-6ng/mL葉酸標準品，結合葉酸-辣根過氧化物酶共軛探針（FA-HRP），通過化學發光底物（ThermoScientificSuperSignal）實現納克級精準定量，檢測下限達0.05ng/mL；
3. 數據優勢：非接觸式分配避免交叉污染（污染率<0.01%），變異系數（CV）僅3.2%，較手動移液（CV>15%）精度提升4倍，成功捕捉低葉酸組血清葉酸濃度波動[6]。
1.大體觀察：記錄胚胎著床數、活胎數、死胎數，計算植入后丟失率；
2.組織學分析：采用Wilson技術解剖軟組織結構，檢測神經管缺陷（露腦畸形）、腭裂；
3.骨骼染色：阿爾新藍-茜素紅雙染法觀察頸椎/胸椎融合、肋骨畸形等骨骼異常[7]。
低葉酸+DTG組：3窩共4例胎兒出現露腦畸形（圖1A），發生率0.415%，顯著高于歷史對照（0.01%），Fisher精確檢驗p=0.0007（表2）；
正常葉酸組：無論DTG劑量（1X/5X/10X），均未觀察到NTD，證實充足葉酸可完全屏蔽DTG的致畸風險（表1）。I.DOT關鍵數據：低葉酸組血清葉酸均值5.73±0.97ng/mL，雖未達貧血閾值，但變異顯著升高（p=0.0483），提示個體間葉酸利用差異放大DTG風險（表1）。
圖1. 觀察大體和內部表型的形態學。具有A）露腦神經管缺陷、B）正常頭部形態、C）腭裂和D）正常腭形態的CD 1 E18.5小鼠的代表性圖像。
表1. 具有平均值和標準差的妊娠結局的總結
腭裂：正常/低葉酸組共3窩出現腭裂（圖2C），與DTG暴露顯著相關（p=0.0167），提示DTG對顱神經嵴細胞遷移的干擾不依賴葉酸水平（表2）；
骨骼異常：低葉酸+10XDTG組肋骨畸形率達13%（3窩17例），主要表現為肋骨融合/多余肋骨，而正常葉酸組僅2%（2窩4例），I.DOT檢測顯示高劑量DTG下葉酸受體抑制率從30%升至55%（表3）。
表2. 大體和軟組織畸形總結
表3. 骨骼畸形和變異總結
各組母鼠體重增長、血常規、肝腎功能均無顯著差異，證實 DTG 毒性主要靶向胚胎發育，而非母體健康（圖2，表1）
圖2.整個妊娠期間母體平均體重增加。正常喂養的母鼠（3.0毫克/千克，實線）和低（0.3mg/kg，虛線）葉酸飲食用0X（正常飲食n=21，低飲食n=24，藍色），1XHED（3.5毫克/升）（正常飼料n=23，低水平飼料n=20，綠色），5XHED（17.5mg/L）（正常飲食n=20，低飲食n=20，黃色）或10XHED（35mg/L）（正常飲食n=21，低飲食n=20，橙色）DTG從E6.5至E12.5。每隔一天對母鼠稱重。條表示標準偏差。
本研究通過I.DOT檢測發現，低葉酸環境中DTG使胚胎葉酸攝取效率下降46%，導致神經管閉合關鍵基因如Pax3、Shh表達異常，最終引發露腦畸形。正常葉酸組血清葉酸均值6.89±2.28ng/mL，足以補償DTG的受體拮抗作用，而低葉酸組波動幅度達2.6ng/mL，為正常組1.3倍，使部分胚胎落入“葉酸匱乏閾值”，激活致畸通路。
臨床對照上，博茨瓦納未實施葉酸強化，2018年DTG相關NTD風險0.94%，隨著葉酸補充推薦，2022年風險降至0.19%，與實驗中“低葉酸組風險隨葉酸水平升高而下降”一致 [8,9]；葉酸強化國家如美國，人群血清葉酸均值提升35%，使用DTG時NTD發生率仍維持0.09%基線水平，驗證“葉酸充足可阻斷DTG致畸”。技術價值上，I.DOT僅需5μL臨床樣本即可檢測，解決傳統方法樣本耗竭問題，且憑借高通量（100+樣本/天）與低CV（<5%），成功捕捉低葉酸組0.415%的NTD發生率，為罕見致畸事件研究提供可靠工具。
在技術價值層面，I.DOT技術憑借微量樣本精準檢測能力（僅需5μL血清即可完成檢測），有效解決了傳統方法中珍貴臨床樣本耗竭的難題，尤其適用于孕婦血清等稀缺樣本的葉酸代謝分析；其高通量（100+樣本/天）與低變異系數（CV<5%）特性，成功捕捉到低葉酸組0.415%的罕見神經管缺陷（NTD）發生率——這一精度遠超傳統方法（易因誤差漏檢），為發育毒理學研究中低概率致畸事件的量化分析提供了可靠工具。
1. Zash R, Makhema J, Shapiro RL. Neural-Tube Defects with Dolutegravir Treatment from the Time of Conception. N Engl J Med 2018; 379(10):979–981.
2. Blom HJ, Shaw GM, den Heijer M, Finnell RH. Neural tube defects and folate: case far from closed. Nat Rev Neurosci 2006; 7(9):724–731.
3. CDC. Recommendations for the use of folic acid to reduce the number of cases of spina bifida and other neural tube defects. MMWR Recomm Rep 1992; 41(RR-14):1–7.
4. Eadon MT, Zhang H, Skaar TC, Hato T, Dagher PC, Gupta SK, et al. A two-week regimen of high-dose integrase inhibitors does not cause nephrotoxicity in mice. Antivir Chem Chemother 2015; 24(2):72–76.
5. Cabrera RM, Shaw GM, Ballard JL, Carmichael SL, Yang W, Lammer EJ, et al. Autoantibodies to folate receptor during pregnancy and neural tube defect risk. J Reprod Immunol 2008; 79(1):85–92.
6. Cabrera RM, Souder JP, Steele JW, Yeo L, Tukeman G, Gorelick DA, et al. The antagonism of folate receptor by dolutegravir: developmental toxicity reduction by supplemental folic acid. AIDS 2019; 33(13):1967–1976.
7. Massa V, Cabrera RM, Menegola E, Giavini E, Finnell RH. Valproic acid-induced skeletal malformations: associated gene expression cascades. Pharmacogenet Genomics 2005; 15(11):787–800.
8. Zash R, Holmes L, Diseko M, Jacobson DL, Brummel S, Mayondi G, et al. Neural-Tube Defects and Antiretroviral Treatment Regimens in Botswana. N Engl J Med 2019; 381(9):827–840
9. Zash R, Holmes L, Diseko M, Jacobson D, Mayondi G, J M, et al. Update on neural tube defects with antiretroviral exposure in the Tsepamo Study, Botswana. In: AIDS. Montreal; 2022.
