除了蛋白質(zhì)的經(jīng)典功能（例如充當(dāng)生物催化劑或結(jié)合partner）之外，還需要考慮蛋白質(zhì)的構(gòu)象狀態(tài)及其在刺激下的重塑。經(jīng)歷全面構(gòu)象重塑的蛋白質(zhì)的一個(gè)突出例子是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶 2 (TGase 2)，其不同的構(gòu)象狀態(tài)與特定功能密切相關(guān)。它參與各種病理生理過程，包括纖維化和癌癥，這推動(dòng)了治療診斷劑的開發(fā)，特別是基于針對轉(zhuǎn)酰胺酶活性的抑制劑。在這種情況下，此類抑制劑控制 TGase 2 構(gòu)象動(dòng)力學(xué)的能力成為一個(gè)重要參數(shù)，所以亟需評估這種特性的方法。本文描述了 switchSENSE® 原理的應(yīng)用，用于檢測由三種不可逆結(jié)合的 Nε -丙烯酰賴氨酸哌嗪引起的構(gòu)象變化，這三種不可逆結(jié)合的 N" -丙烯酰賴氨酸哌嗪是 TGase 2 的合適放射性示蹤劑候選物。switchSENSE® 技術(shù)基于由交變電場驅(qū)動(dòng)的 DNA 納米桿。這些杠桿的一端固定在金電極上，而杠桿的另一端則與 TGase 2 共價(jià)結(jié)合。通過一種新的計(jì)算方法來描述由此產(chǎn)生的杠桿運(yùn)動(dòng)，以量化刺激的構(gòu)象 TGase 2 變化的程度。此外，作為一種補(bǔ)充的生物物理方法，在類似條件下進(jìn)行了天然聚丙烯酰胺凝膠電泳以驗(yàn)證結(jié)果。這兩種方法都證明了 三種研究的 Nε -丙烯酰賴氨酸哌嗪的結(jié)合引起了TGase 2 的構(gòu)象平衡發(fā)生了不可逆轉(zhuǎn)變。
蛋白質(zhì)是構(gòu)象動(dòng)態(tài)分子，即使在其天然狀態(tài)下也會經(jīng)歷一系列構(gòu)象 [1,2]。因此，人們利用構(gòu)象自由能圖景制定了一個(gè)熱力學(xué)概念，描述構(gòu)象亞態(tài)和蛋白質(zhì)的波動(dòng) [2–4]。從生化過程來看，蛋白質(zhì)構(gòu)象集合的重塑是細(xì)胞信號傳導(dǎo)的核心方面 [5]。它也可以被視為一種離散信號傳導(dǎo)[6]。構(gòu)象靈活性是蛋白質(zhì)的固有特性。然而，運(yùn)動(dòng)的種類和程度可能有所不同，從鍵振動(dòng)和側(cè)鏈旋轉(zhuǎn)到域的集體運(yùn)動(dòng) [3,7]。關(guān)于后一種蛋白質(zhì)運(yùn)動(dòng)，已知經(jīng)歷顯著構(gòu)象重塑的蛋白質(zhì)是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶 2 (TGase 2)。TGase 2 是一種酶，它通過將蛋白質(zhì)結(jié)合的谷氨酰胺殘基的酰基轉(zhuǎn)移到一級胺（轉(zhuǎn)酰胺酶活性），包括蛋白質(zhì)結(jié)合的賴氨酸殘基和低分子量的生物胺和多胺，來催化 Ca2+ 依賴性的蛋白質(zhì)翻譯后修飾 [8,9]。除了這種酶功能外，TGase 2 還具有其他酶和非酶功能。例如，TGase 2 結(jié)合和水解 GTP 并充當(dāng)二聚 Gh 蛋白的 Gαh 亞基 [10–12]。在此背景下，Ca2+和GDP/GTP分別作為GTP結(jié)合功能和轉(zhuǎn)酰胺酶活性的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑。此外，這些分子的結(jié)合伴隨著TGase 2的構(gòu)象重塑[10,13]。
TGase 2 是一種單體蛋白，由 687 個(gè)氨基酸組成，摩爾質(zhì)量為 77 kDa [14]。TGase 2 的結(jié)構(gòu)由四個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域組成。N 端 β 夾層（氨基酸殘基 1-139）后面是 α/β 催化核心（氨基酸殘基 140-454），其中包含轉(zhuǎn)酰胺酶活性的催化三聯(lián)體（Cys-277、His-335 和 Asp-358）。該結(jié)構(gòu)由兩個(gè)連續(xù)的 β 桶（氨基酸殘基 479-585 和 586-687）完成。核苷酸結(jié)合（GDP、GTP、ATP）TGase 2 的 X 射線晶體結(jié)構(gòu)揭示了 TGase 2 的緊湊（“封閉”）構(gòu)象，其中 C 端 β 桶狀結(jié)構(gòu)折疊在 α/β 催化域前方（圖 1A）[15,16]。與核苷酸結(jié)合的 TGase 2 相反，與不可逆結(jié)合肽抑制劑復(fù)合的 TGase 2 的 X 射線晶體結(jié)構(gòu)揭示了細(xì)長的（“開放”）構(gòu)象，其中 C 端 β 桶狀結(jié)構(gòu)不會遮擋進(jìn)入轉(zhuǎn)酰胺酶活性位點(diǎn)的通道（圖 1B）[17]。α/β 催化核心與后續(xù) β 桶狀結(jié)構(gòu)之間的柔性環(huán)（氨基酸殘基 455–478）被認(rèn)為是鉸鏈區(qū)，允許 β 桶狀結(jié)構(gòu)移動(dòng) [15,17–19]。盡管抑制劑結(jié)合的 TGase 2 的結(jié)晶是在 Ca2+ 存在下進(jìn)行的，因?yàn)?Ca2+ 是結(jié)合轉(zhuǎn)酰胺酶定向化合物所必需的，但在抑制劑結(jié)合結(jié)構(gòu)中未發(fā)現(xiàn) Ca2+。因此，人們通常假設(shè)但推測“開放”構(gòu)象是否是 Ca2+ 激活構(gòu)象（或它們的集合）的代表性快照。在這種情況下，在解析 TGase 2 的第一個(gè)晶體結(jié)構(gòu)之前，Carlo Bergamini 團(tuán)隊(duì)根據(jù)因子 XIIIa（TGase 家族的另一個(gè)成員）的同源模型進(jìn)行了小角度輻射散射（SAXS 和 SANS）和蒙特卡羅實(shí)驗(yàn)。他們的結(jié)果表明，Ca2+ 的結(jié)合導(dǎo)致 C 端 β 桶的最小旋轉(zhuǎn)，從而揭示了活性位點(diǎn) [18,19]。同樣，Di Venere 等人 根據(jù)光譜技術(shù)（CD、穩(wěn)態(tài)和動(dòng)態(tài)熒光）的結(jié)果，認(rèn)為 Ca2+ 會誘導(dǎo) TGase 2 結(jié)構(gòu)的“開放”[20]。除了結(jié)晶、輻射散射、光譜和模擬方法外，還通過其他各種方法評估了 TGase 2 的構(gòu)象變化[21]。這些方法包括電泳法，例如天然（非變性）凝膠電泳[17,22–27]、動(dòng)力學(xué)毛細(xì)管電泳[28,29]和通過質(zhì)譜監(jiān)測的氫/氘交換（HDX-MS）[30]。雖然這些方法主要側(cè)重于研究分離的 TGase 2 和各種配體的構(gòu)象效應(yīng)，但基于 F?rster 共振能量轉(zhuǎn)移的分析被用于研究活細(xì)胞中 TGase 2 的構(gòu)象動(dòng)力學(xué)[31,32]。所有提及的研究都證明，TGase 2 在核苷酸結(jié)合形式和 Ca2+ 激活或抑制劑結(jié)合形式之間發(fā)生了顯著的構(gòu)象重塑。
由于細(xì)胞內(nèi) GTP（≈100–150 μM）和 Ca2+（≈0.1 μM）濃度，TGase 2 在細(xì)胞內(nèi)采用與“閉合”構(gòu)象相關(guān)的構(gòu)象，因此在生理?xiàng)l件下被認(rèn)為基本上不具有轉(zhuǎn)酰胺酶活性 [31–33]。在與 Ca2+ 穩(wěn)態(tài)喪失相關(guān)的生理應(yīng)激情況下，會發(fā)生向“開放”構(gòu)象的構(gòu)象重塑；事實(shí)上，Ca2+ 水平會升高，蛋白質(zhì)會變得具有轉(zhuǎn)酰胺酶活性 [31,32]。而轉(zhuǎn)酰胺酶TGase 2 主要在細(xì)胞外環(huán)境中發(fā)揮 TGase 活性，并被認(rèn)為與纖維化 [34–37]和乳糜瀉 [38,39] 等病理生理過程有關(guān)。各種腫瘤實(shí)體的特征是 TGase 2 表達(dá)增加，這與不良預(yù)后有關(guān) [40]。此外，TGase 2 似乎對癌癥干細(xì)胞的存活至關(guān)重要 [41–44]。這使得 TGase 2 成為治療診斷方法中一個(gè)有吸引力的腫瘤相關(guān)靶點(diǎn)，主要關(guān)注轉(zhuǎn)酰胺酶活性導(dǎo)向的共價(jià)抑制劑，其誘導(dǎo) TGase 2 構(gòu)象重塑為“開放”構(gòu)象。通過這些藥物的作用，轉(zhuǎn)酰胺酶活性受到抑制，GTP 的結(jié)合受到阻斷 [45–47]。此外，有人認(rèn)為這種構(gòu)象重塑本身具有細(xì)胞毒性 [48,49]。因此，評估新化合物對 TGase 2 構(gòu)象動(dòng)力學(xué)的影響非常重要。
一種用于此類評估的新興技術(shù)是 switchSENSE®，如圖 2 所示。這種動(dòng)態(tài)方法基于金電極上的電驅(qū)動(dòng) DNA 杠桿與高度時(shí)間分辨的熒光檢測相結(jié)合。除了多聚陰離子性質(zhì)外，杠桿理想情況下還應(yīng)具有盡可能大的機(jī)械剛度。因此，在大多數(shù)情況下，雙鏈 (ds) DNA [50–52]，在某些情況下，特別是當(dāng)需要驅(qū)動(dòng)較重的蛋白質(zhì)時(shí)，甚至更硬的 DNA 折紙結(jié)構(gòu)也被用作杠桿 [53,54]。為了在表面上制備此類致動(dòng)器，金電極用硫醇修飾的單鏈 (ss) DNA 寡核苷酸進(jìn)行功能化。這些 ssDNA 鏈中的每一條都在其硫醇部分的對面末端帶有熒光團(tuán)。在本研究中，第一步，通過表面結(jié)合寡核苷酸與互補(bǔ) ssDNA 鏈雜交形成 48 個(gè)堿基對長的 dsDNA 桿（圖 2A）。然后，通過電觸發(fā)時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù) (E-TCSPC) 記錄所得的 16.3 nm 長的裸 dsDNA 桿的運(yùn)動(dòng)。當(dāng)分別通過向電極施加正或負(fù)電位使桿被電極吸引或排斥時(shí)，這種動(dòng)態(tài)模式能夠以 100 ns 的時(shí)間分辨率檢測熒光強(qiáng)度。熒光強(qiáng)度與熒光團(tuán)與金表面的距離相關(guān)。由于能量轉(zhuǎn)移，隨著熒光團(tuán)與金表面之間距離的減小，熒光不斷猝滅。 [55]
在獲取裸 dsDNA 杠桿運(yùn)動(dòng)動(dòng)力學(xué)的參考值后，隨后進(jìn)行脫雜化，為 TGase 2-ssDNA 結(jié)合物提供帶有 ssDNA 的電極表面。然后通過將電位從正值切換到負(fù)值來研究其遠(yuǎn)端共價(jià)結(jié)合有 TGase 2 的所得雙鏈杠桿（圖 2B、C）。與裸 dsDNA 杠桿的運(yùn)動(dòng)相比，TGase 2-dsDNA 結(jié)合物的運(yùn)動(dòng)速度減慢，因?yàn)榻Y(jié)合物的流體動(dòng)力學(xué)流動(dòng)阻力較大。后者改變的程度取決于附著的 TGase 2 的實(shí)際構(gòu)象。為了量化由不同效應(yīng)物引起的 TGase 2 構(gòu)象變化的程度，本文使用了熒光強(qiáng)度增加（TGase 2-dsDNA 結(jié)合物向上運(yùn)動(dòng)）的動(dòng)力學(xué)中的最大斜率（圖 2D）。“閉合” TGase 2 構(gòu)象表現(xiàn)出大約 10 nm 的整體延伸，而“開放”構(gòu)象則約為 15 nm（圖 1A、B）。因此，“閉合”構(gòu)象預(yù)計(jì)會有更快的動(dòng)態(tài)。在 switchSENSE® 技術(shù)的所謂靜態(tài)模式下，恒定電場使 DNA 杠桿相對于金電極保持直立 [56]。在這些條件下，可以通過熒光近距離傳感檢測分析物的結(jié)合。也就是說，分子相互作用以及靠近熒光團(tuán)的構(gòu)象變化可能會改變其局部環(huán)境，因此，熒光信號可以增強(qiáng)或減弱。在本研究中，我們表征了一種最近描述的（1，圖 1C）和兩種新的 N" -丙烯酰賴氨酸衍生的 TGase 2 不可逆抑制劑（2 和 3，圖 1C），以及它們對構(gòu)象動(dòng)力學(xué)的影響，使用 switchSENSE®。Staffler 等人 [57] 最近證明了該方法對 TGase 2 的適用性，主要側(cè)重于評估 GTP 類似物的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。在此，研究了兩種不同的 TGase 2 與寡核苷酸結(jié)合策略（非定向和 His 標(biāo)簽定向胺結(jié)合）。此外，評估了 DMSO（1-3 儲備溶液的溶劑）和 Ca2+（轉(zhuǎn)酰胺酶活性 TGase 2 所必需的）對裸 dsDNA 杠桿運(yùn)動(dòng)的影響，以發(fā)現(xiàn)溶劑組成，避免了與杠桿相互作用而產(chǎn)生的偽影。關(guān)于動(dòng)態(tài)模式下的數(shù)據(jù)分析，引入了一種新穎的計(jì)算方法，該方法包括將雙邏輯函數(shù)擬合到時(shí)間分辨的歸一化熒光強(qiáng)度。
對于 hTGase 2（以 His6 標(biāo)記蛋白的形式購買）與 ssDNA 的結(jié)合，使用市售偶聯(lián)試劑盒應(yīng)用了兩種不同的共價(jià)結(jié)合策略。第一種策略使用用 NHS 酯修飾的 ssDNA 通過其 N 端或賴氨酸側(cè)鏈標(biāo)記 hTGase 2（以下稱為“非定向標(biāo)記”）。對于第二種策略，采用 DNA 模板化蛋白質(zhì)結(jié)合方法，使用 trisNTA 功能化的引導(dǎo) DNA 將 NHS 功能化的 ssDNA 引導(dǎo)至 hTGase 2 的 N 端附近（以下稱為“His 標(biāo)簽定向標(biāo)記”）[62]。第二種策略旨在實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)選擇性蛋白質(zhì)結(jié)合，而非通過非定向標(biāo)記隨機(jī)結(jié)合到任何可用的氨基上。通過這兩種策略，hTGase 2 成功與 ssDNA 偶聯(lián)，并純化了蛋白質(zhì)-DNA 復(fù)合物（。然而，非定向標(biāo)記提供的 ssDNA-hTGase 2 結(jié)合物的產(chǎn)量高于 His-tag 定向標(biāo)記（基于所用的 hTGase 2 量，純化結(jié)合物的產(chǎn)量分別為 27% 和 11%）。值得注意的是，這兩種標(biāo)記類型都使 ssDNA-hTGase 2 結(jié)合物與 ssDNA 功能化芯片的雜交效率相似。雜交后，在兩種情況下，在動(dòng)態(tài)模式下操作期間，hTGase 2 結(jié)合的 dsDNA 桿與裸 dsDNA 桿的時(shí)間依賴性熒光信號有明顯差異（圖 2），即觀察到附著蛋白質(zhì)的 DNA 桿向上運(yùn)動(dòng)較慢。
為了評估兩種標(biāo)記類型的 GTPγS 結(jié)合動(dòng)力學(xué)和 hTGase 2 伴隨的構(gòu)象變化，首先應(yīng)用靜態(tài)模式。為此，將 20 nM GTPγS 沖洗到電極上。在 GTPγS 存在下，熒光信號增加（結(jié)合，圖 3）；通過去除核苷酸，熒光信號降低（解離，圖 3）。兩個(gè) hTGase 2-dsDNA 杠桿的曲線模式相似。然而，與非定向標(biāo)記（圖 3A）相比，His 標(biāo)簽定向標(biāo)記（圖 3B）提供了略高的熒光增加，同時(shí)伴有更高的信噪比。根據(jù)方程 (5) 和 (8) 進(jìn)行回歸分析（參見材料和方法）給出了結(jié)合和解離的速率常數(shù)。解離常數(shù) Kd 總結(jié)在表 1 中。兩種標(biāo)記類型都產(chǎn)生了可比的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，Kd 值與 Staffler 等人在類似條件下獲得的值一致 [57]。
此外，GTPγS 和 Ca2+ 與 hTGase 2 的結(jié)合應(yīng)在動(dòng)態(tài)模式下影響 hTGase 2-dsDNA 杠桿的向上運(yùn)動(dòng)。與 DNA 杠桿結(jié)合的蛋白質(zhì)的尺寸估計(jì)通常基于計(jì)算相應(yīng)的流體動(dòng)力學(xué)直徑，同時(shí)考慮蛋白質(zhì)-DNA 結(jié)合物的切換運(yùn)動(dòng)和裸露的 DNA 杠桿的切換運(yùn)動(dòng) [56]。然而，一方面，已知 TGase 2 結(jié)構(gòu)是非球形的，另一方面，一組構(gòu)象可能對測量的時(shí)間分辨熒光強(qiáng)度有貢獻(xiàn)。因此，所謂的“棒棒糖模型”可能不是最有利于構(gòu)象變化分析的。特別是對于 TGase 2，Staffler 等人 [57] 報(bào)告了他們從 switchSENSE® 得出的流體動(dòng)力學(xué)直徑與從晶體結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)光散射測量計(jì)算出的值之間存在明顯差異。因此，開發(fā)了一種新的計(jì)算方法，包括將雙邏輯函數(shù)擬合到時(shí)間分辨的歸一化熒光強(qiáng)度。在此基礎(chǔ)上，計(jì)算了擬合函數(shù)拐點(diǎn)處的最大斜率。該斜率的倒數(shù)應(yīng)該與結(jié)合蛋白或蛋白-抑制劑復(fù)合物的結(jié)構(gòu)變化引起的摩擦幾乎成比例。這意味著 DNA 桿向上運(yùn)動(dòng)的速度越慢，倒數(shù)斜率就越高，摩擦力也就越大。在這種情況下，我們假設(shè)結(jié)合酶的流體動(dòng)力學(xué)摩擦取決于其構(gòu)象（圖 2）。預(yù)計(jì)“開放”構(gòu)象（圖 1B）將比“封閉”構(gòu)象（圖 1A）產(chǎn)生更高的摩擦力。因此，時(shí)間依賴性的歸一化熒光強(qiáng)度應(yīng)顯示更大的最大斜率，因此“封閉”構(gòu)象的倒數(shù)斜率應(yīng)小于“開放”構(gòu)象（圖 2D）。此外，事實(shí)證明，將一系列要比較的條件中的所有倒數(shù)斜率除以在相關(guān)連續(xù)之前直接測量的裸 DNA 桿的倒數(shù)斜率是有利的。然后使用以這種方式獲得的相對倒斜率來量化酶的構(gòu)象變化。Knezevic 等人 [50] 描述了一種類似的方法，即計(jì)算由快速傅里葉變換濾波器平滑的時(shí)間依賴性熒光曲線的一階導(dǎo)數(shù)的最大值。盡管如此，擬合雙邏輯函數(shù)來確定拐點(diǎn)還是有一些優(yōu)勢的。此處使用的雙邏輯函數(shù)是適用于“S”形曲線的 S 形函數(shù)。該函數(shù)由兩個(gè)邏輯函數(shù)的總和形成 [63]。借助雙邏輯函數(shù)，可以充分描述歸一化熒光強(qiáng)度的完整、通常不對稱的時(shí)間分辨曲線。特別是，可以可靠地近似拐點(diǎn)周圍的區(qū)域。從得到的顯式最佳擬合函數(shù)中，可以獲得任意階的導(dǎo)數(shù)函數(shù)（相對于時(shí)間導(dǎo)出），以確定具有最大斜率的拐點(diǎn)。
事實(shí)上，在存在 GTPγS 的情況下，相對逆斜率明顯小于純緩沖液中不含 GTPγS 的情況（圖 4），因?yàn)橐阎?GTP 類似物會使 TGase 2 的構(gòu)象動(dòng)力學(xué)向“閉合”構(gòu)象轉(zhuǎn)變（圖 1A）。隨后去除 GTPγS 并暴露于 Ca2+ 會增加相對逆斜率，甚至超過在沒有任何效應(yīng)物的情況下 hTGase 2-dsDNA 杠桿的值（圖 4；有關(guān)動(dòng)力學(xué)，請參閱補(bǔ)充材料中的圖 S2）。這反過來又與最近的數(shù)據(jù)一致，表明 Ca2+ 的結(jié)合有利于 TGase 2 形成相當(dāng)細(xì)長的構(gòu)象 [18–20,29,32]，這應(yīng)該會增加 DNA 杠桿的摩擦力（圖 2B）。在這種情況下，TGase 2 的構(gòu)象重塑可能是各種中間構(gòu)象的動(dòng)態(tài)平衡，這有助于 hTGase 2-dsDNA 杠桿的摩擦力。因此，在沒有任何效應(yīng)器的情況下，觀察到的摩擦力大概是中等強(qiáng)度的。
通過比較不同標(biāo)記類型的結(jié)果，可以明顯看出 His 標(biāo)簽引導(dǎo)標(biāo)記產(chǎn)生的相對倒數(shù)斜率值明顯更高（p < 0.001）（圖 4）。這與在靜態(tài)模式下評估的 GTPγS 結(jié)合動(dòng)力學(xué)的結(jié)果一致（圖 3）。因此，TGase 2 與 ssDNA 的位點(diǎn)選擇性偶聯(lián)（此處通過 His 標(biāo)簽引導(dǎo) DNA）對 switchSENSE® 兩種測量模式的數(shù)據(jù)質(zhì)量都有積極影響，Staffler 等人最近也提出了這一建議 [57]。特別是對于 TGase 2，靠近 N 端的功能化是有利的，因?yàn)樵谟?GTP 類似物和 Ca2+ 刺激時(shí)，N 端 β 夾層較少參與構(gòu)象重塑。但是，如上所述，His 標(biāo)簽引導(dǎo)標(biāo)記的主要缺點(diǎn)是制備結(jié)合物期間產(chǎn)量低。因此，我們決定利用非定向標(biāo)記獲得的 hTGase 2-ssDNA 進(jìn)行抑制劑 1-3 的構(gòu)象影響實(shí)驗(yàn)。
在分析抑制劑 1–3 對 TGase 2 構(gòu)象動(dòng)力學(xué)的影響之前，必須評估它們的抑制效力。雖然之前已顯示化合物 1 具有出色的抑制效力 [64]，但化合物 2 和 3 代表新化合物。使用熒光測定法測定 2 和 3 的動(dòng)力學(xué)抑制效力 [65]，結(jié)果顯示 kinact/KI 值分別為 8340 M?1 s ?1 和 4500 M?1 s ?1 (表 2)。此外，在蛋白質(zhì)和抑制劑預(yù)孵育 5 分鐘后，用熒光各向異性 (FA) 分析法測定了抑制轉(zhuǎn)酰胺酶活性的 IC50 值（2 和 3 分別為 154 和 280 nM，表 2）[64,66]。對于 SDS-PAGE 和天然 (GTP-)PAGE 實(shí)驗(yàn)，我們使用了自制的 Twin-Strep 標(biāo)記的 hTGase 2，該酶被化合物 1-3 抑制，其 IC50 值在市售的 His 標(biāo)記的 hTGase 2 的范圍內(nèi)（表 2，補(bǔ)充材料中的圖 S3）
由于溶解度有限，抑制劑 1–3 的儲備溶液通常在 DMSO 中制備，因此用于生化和生物測定的最終 DMSO 濃度在 0.1% 至 5% 之間。為了確定 DMSO 的潛在干擾，我們使用不同的溶劑成分評估了裸露 DNA 桿的向上運(yùn)動(dòng)（圖 5）。雖然施加濃度為 1 mM 的 Ca2+ 不會改變時(shí)間依賴性熒光曲線的形狀，但與純水條件相比，1% DMSO 會導(dǎo)致曲線左移（圖 5A）。幸運(yùn)的是，當(dāng) DMSO 濃度降低到 0.1% 時(shí)，曲線的形狀與水條件下的形狀基本相同（圖 5B）。因此，對于所有使用抑制劑 1–3 的 switchSENSE® 實(shí)驗(yàn)，最終 DMSO 濃度均設(shè)置為 0.1%。目前無法給出觀察到 DMSO 影響的原因，但結(jié)果強(qiáng)調(diào)了仔細(xì)評估溶劑成分以避免測量偽影的必要性。
在驗(yàn)證了它們的抑制活性并找到了合適的溶劑組成后，評估了化合物 1-3 對 hTGase 2 的構(gòu)象影響。為此，應(yīng)用了以下處理順序。（圖 6 中使用的所得溶劑組成和/或 hTGase 2-dsDNA 桿的狀態(tài)的符號用引號給出。）
1. 純 TE40 緩沖液（“w/o”）；
2. 含 1 mM Ca2+ 的 TE40（“Ca2+”）；
3. 純 TE40 緩沖液（去除 Ca2+；“Ca2+ 之后”）；
4. 含 1 mM Ca2+ 和 10 μM 抑制劑的 TE40（“Ca2++ 抑制劑”）；
5. 純 TE40（去除 Ca2+ 和抑制劑；“Ca2++ 抑制劑之后”）。
圖 6 顯示了相對倒數(shù)斜率對 hTGase 2-dsDNA 杠桿向上運(yùn)動(dòng)的影響。如前所述（圖 4），添加 Ca2+ 會增加摩擦力，因此，hTGase 2-dsDNA 杠桿的時(shí)間依賴性歸一化熒光強(qiáng)度曲線中的相對倒數(shù)斜率也會增加，在去除 Ca2+ 后，該曲線幾乎與添加 Ca2+ 之前相同（差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，圖 6 和 S4）。同時(shí)添加 Ca2+ 和抑制劑似乎會使摩擦力增加到比單獨(dú)添加 Ca2+ 更高的值（但這種差異對于所有抑制劑而言都不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，補(bǔ)充材料中的圖 6 和 S4）。對于抑制劑 3，隨后去除 Ca2+（“Ca2+ + 抑制劑之后”）會使摩擦力降低到與單獨(dú)添加 Ca2+（“Ca2+”）相似的水平，但與“w/o”和“Ca2+ 之后”相比仍顯著更高（圖 6）。對于抑制劑 1 和 2，這種趨勢相似；然而，應(yīng)該注意的是，“Ca2++ 抑制劑后”與“w/o”和“Ca2+ 后”的差異中只有部分具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（補(bǔ)充材料中的圖 S4）。因此，數(shù)據(jù)可能表明這三種抑制劑在不可逆結(jié)合后將 hTGase 2 的構(gòu)象平衡轉(zhuǎn)變?yōu)楦煺沟臉?gòu)象。Staffler 等人 [52] 最近使用 switchSENSE® 對肽類不可逆抑制劑 Z-DON-Val-Pro-Leu-OMe（“Z-DON”）獲得了類似的結(jié)果。面對不同條件之間相對逆斜率的輕微變化以及隨著治療周期的增加電極的某些老化效應(yīng)，有必要使用互補(bǔ)方法來可視化由于配體的共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合而導(dǎo)致的 hTGase 2 的構(gòu)象變化。
heliX+分子互作分析系統(tǒng)采用switchSENSE®技術(shù)，通過共價(jià)偶聯(lián)或標(biāo)簽捕獲方式將感興趣的分 子（配體）固定在heliX®芯片上,結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)的自動(dòng)化 工作流程為分子互作提供高效解決方案。
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